高純度質(zhì)粒大量快速提取試劑盒
HighPure Rapid Maxi Plasmid Kit
保存條件：本產(chǎn)品收到后按照上面指示溫度存放各成份，儲存 18 個(gè)月不影響使用效果。
產(chǎn)品介紹：
本試劑盒采用改進(jìn) SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH 值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質(zhì)粒 DNA，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細菌成分去除，后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
- 離心吸附柱內硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩定的弊端。
- 不需要使用有毒的苯酚、氯-fang等試劑，也不需要乙醇沉淀?？焖?、方便，從 100-200ml 大腸桿菌 LB 培養液中，可快速提取 0.2-0.5mg 純凈的高拷貝質(zhì)粒 DNA，提取率達80 %左右。
3. 獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、超螺旋比例高、純度好，可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗。
注意事項：
1. 第--次使用時(shí)，將試劑盒所帶全部的 RNase A 加入溶液 P1 后（終濃度 100μg/ml） 置于 4℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的質(zhì)?？赡軙?huì )有微量 RNA 殘留， 在溶液 P1 中補加 RNase A 即可。
2. 環(huán)境溫度低時(shí)溶液 P2 中 SDS 可能會(huì )析出出現渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過(guò)量的泡沫。
3. 避免試劑長(cháng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化。
4. 溶液 P3 和去蛋白液 PD 中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5. 提取質(zhì)粒的量與細菌培養濃度、質(zhì)?？截悢档纫蛩赜嘘P(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?10kb 的大質(zhì)粒，應加大菌體使用量，同時(shí)按比例增加 P1、P2、P3 的用量， 洗脫緩沖液應在 70℃預熱?？梢赃m當的延長(cháng)吸附和洗脫的時(shí)間，提高提取效率。
- 得到的質(zhì)粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260 值為 1 相當于大約 50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為 2 條或者多條DNA 條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質(zhì)粒泳動(dòng)位置不一造成，與提取物培養時(shí)間長(cháng)短、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過(guò) 90%。
- 洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫， 但應該確保 pH 大于 7.5，pH 過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫，質(zhì)粒應該保存－20℃。質(zhì)粒DNA 如果需要長(cháng)期保存，可以用 TE 緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA， pH 8.0），但是 EDTA 可能影響下游酶切反應，使用時(shí)可以適當稀釋。
自備試劑：無(wú)水乙醇操作步驟：
提示：
ð 第--次使用前請先在漂洗液 WB 瓶中加入 200ml 無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請及時(shí)在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
ð 將 RNase A 全部加入溶液 P1 中，混勻。每次使用后置于 2-8℃保存。
ð 將溶液 P3 放在冰上預冷。
1. 柱平衡步驟：向吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中）加 1ml 平衡液 BL，12,000rpm
離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當天處理柱子）
2. 取 100-200 毫升過(guò)夜培養的菌液，6000xg 離心 10 min，盡可能的倒干上清，收集菌體。
3. 用 7ml 溶液P1 重懸菌體沉淀，移液器吹打或者渦旋振蕩至*懸浮。
4. 加 7ml 的溶液P2，溫和地上下翻轉 4 -7 次使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。
5. 加 10ml 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉 4 -7 次，充分混勻此時(shí)會(huì )出現白色絮狀沉淀。冰上靜置 5-10 min，4℃條件下 2500xg 離心 20 min(加大離心力可相應縮短離心時(shí)間, 如 15000xg 離心 10 min)，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。
6. 將上一步所得上清加入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中），靜置 2 min，2500xg
離心 2 min，倒掉收集管中的廢液。
7. 加入 10ml 去蛋白液 PD，2500xg 離心 2 min，棄掉廢液。
8. 加入 10ml 漂洗液 WB（請先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），2500xg 離心 2 min，棄掉廢液。
9. 重復操作步驟 8。
- 將吸附柱 AC 放回空收集管中，zui高速（大于 9000xg，如果離心機轉速低，需要相應延長(cháng)離心時(shí)間）離心 10 min，去除基質(zhì)膜上的乙醇殘留，用槍頭吸除內圈壓環(huán)和柱壁之間可能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾干幾分鐘。
11. 可選步驟: 選擇以下兩種方法之一干燥柱子：
a. 取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空 15 min；
b. 將柱子放置于 60-65℃真空干燥箱或烘箱中，放置 10-15 min。
12. 取出吸附柱 AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加 1-1.5ml 洗脫緩沖液EB（事先在 65-70℃水浴中預熱效果更好），室溫放置 2 min，6000xg 離心 5 min。需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心 2 min。（注意：洗脫液的 pH 值對于洗脫效率有很大影響。(注意：若用 ddH2O 做洗脫液應保證其 pH 值在 7.5-8.0 圍內，pH 值低于 7.0 會(huì )降低洗脫效率。洗脫緩沖液用量的多少主要是依據質(zhì)粒的拷貝數以及實(shí)驗所需要的濃度來(lái)確定。洗脫緩沖液體積不少于 1 ml，體積過(guò)小影響回收效率。DNA 產(chǎn)物應保存在-20℃，以防 DNA 降解。）
