HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)
HiFi-MMLV One Step RT-PCR Kit
HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒
目錄號：K0745
保存條件：-20℃保存。
組分說(shuō)明
Cat. No. K0745
Kit Size 100
HiFi-MMLV OneStep RT- PCR EnzymeMix 50 μl
2×OneStep RT-PCR Buffer 1.4 ml
RNase-Free Water 1 ml
本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒是專(zhuān)為一步法RT-PCR實(shí)驗研制，逆轉錄和PCR在同一反應體系中進(jìn)行，
反應過(guò)程中無(wú)需添加試劑，無(wú)需打開(kāi)管蓋，在避免污染的同時(shí)提高了檢測靈敏度和實(shí)驗
效率。本試劑盒包括逆轉錄酶、快速熱啟動(dòng) DNA聚合酶，同時(shí)包含適用于逆轉錄和
PCR擴增的反應緩沖液和實(shí)驗中所必需的反應組分。HiFi-MMLV逆轉錄酶RNase H活性
缺失，減少了逆轉錄反應中RNA的降解。HiFi-MMLV逆轉錄酶熱穩定性強，可獲得高產(chǎn)
量的cDNA。PCR反應使用的快速熱啟動(dòng)DNA聚合酶具有擴增效率高、延伸速度快的優(yōu)
良性能。*的緩沖體系使逆轉錄酶和聚合酶同時(shí)發(fā)揮大功效。使用本試劑盒擴增得
到的目的產(chǎn)物3′端附有一個(gè)″A″堿基，可直接用于T/A克隆。
注意事項
1．在操作過(guò)程中應避免RNase污染，防止RNA降解或實(shí)驗中的交叉污染，建議在專(zhuān)門(mén)
的區域進(jìn)行RNA操作，使用專(zhuān)門(mén)的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)
常更換手套。
2．實(shí)驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙
酯）水溶液在37℃處理12小時(shí)，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃
器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實(shí)驗中用到的無(wú)菌水應使用 0.1%的DEPC
處理后進(jìn)行高壓滅菌。
3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心
后使用。所涉及的酶類(lèi)使用后應盡快放回-20℃，避免反復凍融。
4．本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據具體實(shí)驗來(lái)選擇，引物設計的好
壞直接影響到RT-PCR 反應的結果，設計引物時(shí)需考慮GC含量，引物長(cháng)度，引物
位置，PCR產(chǎn)物的二級結構等因素，建議采用專(zhuān)業(yè)的引物設計軟件來(lái)設計。
使用方法
1．將RNA模板、引物、 OneStep RT-PCR Buffer、OneStep RT-PCR EnzymeMix
和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。
2．根據以下表格配制反應體系：
試劑 25 μl反應體系 終濃度
2×One Step RT-PCR Buffer 12.5 μl 1×
Forward Primer，10 µM 1 μl 0.4 μM
Reverse Primer，10 µM 1 μl 0.4 μM
HiFi-MMLV OneStep RT-PCR EnzymeMix 0.5 μl
RNA Template X μl 10 pg –1 µg
RNase-Free water up to 25 μl
注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。
3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。
4．將熱循環(huán)儀預熱到45℃，將PCR管置于熱循環(huán)儀中，進(jìn)行RT-PCR反應。
反應條件：
步驟 溫度 時(shí)間
反轉錄 45℃ 30 min
PCR預變性 95℃ 2 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 30-40個(gè)循環(huán)
延伸 72℃ 30 s
終延伸 72℃ 5 min
注意：1）一般PCR實(shí)驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時(shí)間一般為20-30秒，無(wú)法得到理想的擴增效率時(shí)，適當降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應條件。
2）延伸時(shí)間根據擴增的片段大小設定，本產(chǎn)品中包含的DNA Polymerase擴增效率為1 kb/30s。
3）可根據擴增產(chǎn)物的下游應用設定循環(huán)數。循環(huán)次數太少，擴增量不足；循環(huán)次數多，錯配機率會(huì )增加，非特異性背景嚴重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應盡量減少循環(huán)次數。
5．反應結束后取5 µl反應產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳檢測結果。
相關(guān)產(chǎn)品信息
目錄號 產(chǎn)品名稱(chēng) 產(chǎn)品特點(diǎn)
YJ0580 TRIzon總RNA提取試劑 適用范圍廣的RNA提取試劑
YJ0581 超純RNA提取試劑盒
兼具有適用范圍廣和純度高特點(diǎn)的RNA提取試劑
K0597 超純RNA提取試劑盒（含DnaseI） 靈敏度高，可識別pg級別的模板。與RNA親和力強，
K0741 SuperRT cDNA第--鏈合成試劑盒能夠通讀GC含量高，二級結構復雜的RNA模板。
K0744 HiFi-MMLV cDNA第--鏈合成試劑盒高效獲得cDNA產(chǎn)物
SuperQuickRT cDNA第--鏈合成試逆轉錄（針對于熒光定量PCR試劑盒(For Real-time PCR)）
K2381 僅需15分鐘，即可完成熒光定量PCR所需的cDNA
SuperQuickRT MasterMix 即用型逆轉錄mix，只需加入RNA和水即可反應。僅
K2391 (for Real-Time PCR) 需15分鐘，即可完成熒光定量PCR所需的cDNA
K0688 Es Taq DNA Polymerase 兼具高擴增效率和高保真性的PCR產(chǎn)品
K0690 Es Taq MasterMix
K0957 UltraSYBR Mixture 熒光定量PCR—SYBR Green法
K0956 UltraSYBR Mixture（With ROX） 特異性強、Ct值低、定量更準確
