LGS1072Z狗骨髓間充質(zhì)干細胞分離液說(shuō)明書(shū)

狗骨髓間充質(zhì)干細胞分離液說(shuō)明書(shū)
【產(chǎn)品規格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶(hù)使用，試劑內容如下：

【實(shí)驗前準備】
A．適用儀器
zui大離心力可達 1200g的水平轉子離心機
B．耗材

【檢驗方法】
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
1.首先制備骨髓單細胞懸液，制備方法詳見(jiàn)“骨髓沖洗單細胞懸液制備技術(shù)”。
2.取一支     15ml離心管，加入與骨髓單細胞懸液等量的分離液（注：分離液zui少不得少于
3ml）。
3.用吸管小心吸取骨髓單細胞懸液加于分離液液面上，400-550g，離心20-30min。（注：
根據骨髓單細胞懸液量確定離心條件，骨髓單細胞懸液量越大，離心力越大，離心時(shí)間
越長(cháng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達到分離效果）。
4.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色目

的細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
5.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色目的細胞層到另一15ml離心管中，向離心管中加入
10ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
6.250g，離心 10min。
7.棄上清。
8.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
9.250g，離心 10min。
10.重復  7、8、9，棄上清后以 0.5ml后續實(shí)驗所需相應液體重懸細胞。
11.差異貼壁法純化細胞
（1）用干細胞無(wú)血清培養基（產(chǎn)品編號： CSC2015TBD）或干細胞*培養基（產(chǎn)品
編號：HCSC2015TBD）以 1.5-3×106個(gè)/ml的密度重懸細胞，將細胞鋪于一次性細胞板
或細胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養箱中進(jìn)行貼壁培養。
（2）2-4小時(shí)內貼壁的為巨噬細胞前體（俗稱(chēng)為單核細胞）。
（3）10-24小時(shí)內貼壁的單個(gè)核細胞為內皮、內皮祖細胞、干細胞。
（4）不貼壁的為淋巴細胞。
注：
a)
無(wú)血清培養基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養效果可添加10%自體血漿或
2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。
b)
c)
*培養基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養的目的細胞而定）。
由于每種細胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細胞分開(kāi)已達簡(jiǎn)單的純化目的，此法成
本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰
性分選。
【注意事項】
1.全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗環(huán)境均需在20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗結果，zui
好在取樣2h內進(jìn)行實(shí)驗，樣品存放時(shí)間越長(cháng)，細胞分離效果越差。樣品放置超過(guò)6h后
分離效果更差甚至不能達到分離目的。
2.本實(shí)驗不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無(wú)靜電、低靜電離
心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面
會(huì )變成毛面，影響細胞分離效果。
3.吸取過(guò)多的目的細胞層及分離液層會(huì )導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒

細胞數量增加。
4.分離液用量大于骨髓單細胞懸液樣本量時(shí)，分離效果更佳。
5.如實(shí)驗后細胞得率或活性過(guò)低，請技術(shù)以尋求支持幫助。
【儲存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2年。本品易感染細菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗淋巴細胞提取率及純度大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細胞的數量及比例，用戶(hù)可適當進(jìn)行參考。

【相關(guān)實(shí)驗技術(shù)方案】
1.骨髓沖洗單細胞懸液制備技術(shù)。
2.所獲得干細胞的培養技術(shù)。
3.所獲得干細胞的核酸提取技術(shù)。
4.所獲得干細胞的鑒定方法。
A.流式細胞技術(shù)
B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR技術(shù)
注：上述技術(shù)方案詳情請登陸本搜索“細胞分離、
純化、擴增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊”，并在說(shuō)明書(shū)項目欄下下載使用。
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1.由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

2.本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
區客戶(hù)可根據當地情況對離心條件進(jìn)行適當調整。建議對離心條件進(jìn)行調整時(shí)，恒定離
心時(shí)間，對離心轉速進(jìn)行調整。
3.本分離液依照標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可
能出現紅細胞沉降不*的情況，可以適當加大離心轉速。
注：在對離心條件進(jìn)行調整時(shí)，離心轉速的加減以 50-100g為基數，直至達到分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min為準。