ELISA直接法測長(cháng)葉車(chē)前花葉病毒（RMV）含量實(shí)驗步驟

1. 將不同濃度的待檢測RMV溶液作為樣品液，在測定板每孔各加250ul,至冰箱（4℃）中孵育過(guò)一夜。
2. 孵育后，去除孔穴內抗原溶液，用PBS-Tween20溶液緩緩沖洗孔穴3次，每次3min，然后去凈洗滌液。
3. 每孔穴加250ulRMV的酶標記抗體溶液（用1%牛血清白蛋白的PBS- ween20稀釋?zhuān)┰诤銣叵洌?/span>37℃）里孵育3-6h,或6℃下過(guò)一夜。
4. 去除孔穴酶標記抗體溶液，用PBS-Tween20溶液緩緩沖洗3次每次3min，然后去凈洗滌液。
5. 每孔穴加入新鮮配備的底物溶液250ul,室溫放置0.5h，或者放置出現黃色。
6. 加入50ul3N NaOH，終止反應。
7. 對每孔穴的黃色溶液，測定449nm波長(cháng)處的吸光值。

討論

1. 如該聚苯乙烯塑料微量反應板*次使用，應分別用標準濃度的RMV溶液、RMV的抗血清及RMV與它的IgG形成的免疫結合物，進(jìn)行期盼滴定法來(lái)測該聚苯乙烯塑料微量反應板對RMV抗原和它的抗體的吸附能力。
2. 在正式測樣品前，用0.1mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液配置各種標準濃度的RMV溶液，依照實(shí)驗步驟測定RMV各種標準濃度的A449nm值，以病毒標準濃度為橫坐標，A449nm值為縱坐標繪制標準曲線(xiàn)，由此可以測出RMV包被的濃度。
3. 測出原始底物的吸光值，以便核準數據。
4. 對照標準曲線(xiàn)，就可算出樣品液中RMV的含量。
5. 如無(wú)牛血清白蛋白，可用0.1%白明膠代替。
6. 對于不穩定的病毒，用中性緩沖液稀釋。
7. 如有ELISA測定儀，可快速測定。

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